Diagnostične metode za virusne in virusne bolezni rastlin

Vizualna diagnostična metoda

V večini primerov ni težko določiti virusne narave bolezni. Običajno ga določajo zunanji znaki, kot so linearni klorotični vzorci ali obročni vzorci na mladih listih. Vendar je njihova identifikacija pogosto težavna, saj imajo virusi asimptomatski (latentni) značaj razvoja. Simptomi so odvisni od stanja organizma, agresivnosti seva patogena, okoljskih razmer in dolžine časa, ko virus ali viroid ostane v celicah gostiteljicah. Na primer, simptomi bolezni so jasno izraženi pri rastlinah, ki rastejo pri močni svetlobi in zmerni temperaturi, visoki temperaturi in slabi osvetlitvi, simptomi bolezni morda sploh niso izraženi..

Pojasnitev žil najmlajših listov je pogosto eden prvih znakov sistemske virusne okužbe. Žile postanejo rumene in prosojne. Kasneje so listi mozaični, pikčasti ali popolnoma rumeni (klorotični)..

Inkubacijska doba bolezni je odvisna od vrste virusa, gostiteljske rastline in okoljskih razmer, vsekakor pa je več dni ali tednov.

Če so prvi simptomi viroze opazni na sadikah, je bil vir okužbe bodisi v semenih, bodisi se je okužba pojavila prek prenašalca. Če se okužene rastline v kulturi nahajajo povsem po naključju ali le v vrstah, posajenih iz iste serije, potem to kaže, da je bil sadilni material najverjetneje okužen. Če na določenih območjih polja najdemo obolele rastline in je pojav okuženih območij posledica razlik v tleh, obstaja vsak razlog za domnevo širjenja virusov po tleh.

Prav tako je treba opozoriti, da obstajajo simptomi, značilni za virozo, vendar jih povzročajo drugi vzroki (lezije fitoplazme, nekatere bakterije in sesalni škodljivci). Simptome, podobne virusni okužbi, pogosto povzročajo motnje prehranjevanja z minerali, kot so simptomi, povezane z pomanjkanjem železa (fig 1) Različne deformacije organov lahko povzročajo rastni regulatorji in različni herbicidi (fig 2).

Tako je z uporabo metode vizualne diagnostike natančna identifikacija z zunanjimi znaki poškodbe virusov in viroidov nemogoča, jasen odgovor je mogoče dobiti le z instrumentalnimi metodami (encimsko imunosorbent test, PCR analiza itd.).

Metoda rastlin indikatorjev

Metoda rastlin indikatorjev - Je zelo pogosta metoda za diagnosticiranje virusnih in virusnih bolezni ter prepoznavanje njihovih povzročiteljev. Metoda rastlin indikatorja temelji na uporabi rastlin indikatorjev, ki v večini primerov dajejo jasne in specifične simptome, značilne za določeno vrsto patogena. Rastlinski indikatorji se okužijo z mehansko inokulacijo s sokom, zato se lahko okužba kaže kot lokalna nekroza, razbarvanje in zaviranje rasti.

Za virus paradižnikove aspermije se kot indikator uporabljajo mlade rastline tobaka (Nicotiana glutinosa), za diagnozo krompirjevega virusa X - sferični amarant (Gomphrena globosa) Za odkrivanje okužbe paradižnika z virusom vretenasti gomolji krompirjevih gomoljev uporabljajo skopolijo kot indikatorje (Scopolia sinensis) ali občutljive sorte paradižnika. V nekaterih primerih lahko za okužbo uporabimo posamezne izolirane liste rastlin indikatorja. Sokovi, odporni na sokove, se cepijo na rastline indikatorje z različnimi metodami. V redkih primerih se za prenos virusa uporabljajo nosilci žuželk in rastlina zajedavcev.

Serološko diagnostična metoda

Metoda temelji na reakciji obarjanja (tvorjenje oborine) med specifičnimi protitelesi in proteini (antigeni) patogena. Metoda serološke diagnoze ni uporabna za identifikacijo virusov zaradi odsotnosti beljakovinskih komponent, pa tudi za številne viruse, ki ne prenašajo sokov, s šibkimi imunogenimi lastnostmi. Za identifikacijo virusov v rastlini lahko uporabimo naslednje modifikacije serološke diagnostike:

1) Encimski imunosorbentni test (ELISA) - najbolj občutljiva metoda, ki vam omogoča pridobivanje količinskih ocen. Temelji na specifičnem prepoznavanju površinskih antigenov virusa s protitelesi v prisotnosti encimov. Ta metoda se v praksi pogosto uporablja za identifikacijo virusov poljščin, primernih za serijske analize.

2) Metoda kapljanja. Izvaja se na naslednji način. Na steklenem diapozitivu zmešamo kapljico rastlinskega soka s kapljico antiseruma. Po nekaj minutah reakcijo ocenimo pod mikroskopom pri majhni povečavi v temnem polju ali celo vizualno, brez mikroskopa.

3) Metoda dvojne difuzije - izvajajo se v agar gelu za določanje sferičnih in drugih majhnih virusov. Izvaja se s to metodo, v nekaterih vrtinah, ki jih razrežemo v sloju agarnega medija, dodamo antiserum, v drugih pa - očiščen rastlinski sok. V gelu se virusni delci in protitelesa med seboj razpršijo, na mestu stičišča pa tvorijo izrazite padavinske črte v primeru svoje komplementarne specifičnosti.

4) Metoda radialne imunodifuzije. S to metodo se antiserum doda neposredno v agarni medij, vdolbinice pa se napolnijo z rastlinskim sokom. Reakcija je pozitivna, če oborine nastanejo obročaste oborine..

5) Metoda adsorpcije. Metoda temelji na dejstvu, da protitelesa pred reakcijo z antigenom vežejo nekaj inertnega materiala na velike delce, na primer na lateks. Pri reakciji z antigenom se pojavi jasno vidna aglutinacija celotnega kompleksa..

Metoda elektronske mikroskopije

Na ultra tankih odsekih obolelih rastlinskih tkiv lahko z uporabo elektronskih mikroskopov določite strukturo, obliko in celo velikost virusov ali virusov. Pogosto se uporablja elektronski mikroskop v kombinaciji s serološkimi metodami (imunoelektronska mikroskopija) in odkrijemo virusne delce s plastnimi protitelesi. Metoda elektronske mikroskopije se uporablja zelo redko zaradi visokih stroškov opreme in reagentov, težavnosti izolacije virusov in viroidov, oksidacije rastlinskih delov in številnih drugih dejavnikov.

Metoda elektroforeze

Ta metoda temelji na ločevanju predhodno očiščenih nukleinskih kislin virusa (viroid) ali njegovih beljakovin v gelu pod vplivom električnega toka, ki mu sledi obarvanje con. Metoda elektroforeze vam omogoča, da določite maso in velikost virusnih ali virusnih struktur. Metoda se široko uporablja za vizualni pregled končnega produkta verižne reakcije polimeraze. Za zapis rezultatov fotografirajte gel v oddani ali odbijani svetlobi.

Molekularno biološke metode temeljijo na poznavanju strukture molekule RNA (DNA) virusa ali viroida. Najpogostejši test je ojačanje (razmnoževanje) vrst, specifičnih za vrsto RNA med verižno reakcijo polimeraze (PCR). Posamezni fragmenti RNA, izolirani iz preučenih rastlin, ki so značilni samo za eno vrsto ali rod virusov, se pomnožijo z encimi v prisotnosti prajmov (ustreznih oligonukleotidov). Poleg tega njihovo število v končnem reakcijskem izdelku milijone krat presega začetno število kopij izbranega fragmenta RNA. Nato virusno RNA (DNK) odkrijemo z gel elektroforezo ali imunofluorescenco. Metoda se široko uporablja v praktičnih viroloških študijah..

Metoda sonde DNA temelji tudi na načelu komplementarnosti nukleinskih kislin. Sintetirajo se specifične sonde, ki hibridizirajo samo s specifičnimi nukleotidnimi zaporedji virusa ali virusne RNA. Glede na izbiro sond je možno razlikovati skupine, vrste in celo seve virusov in virusov.

Metoda vključitve

Po razvoju virusov se v rastlinskih celicah tvorijo grozdi virusnih delcev (vključki), imenovani Ivanovski kristali, ki so vidni z običajnim svetlobnim mikroskopom. Vsak virus ima svojo obliko virusnih vključkov, ki se najpogosteje oblikujejo v celicah povrhnjice listov ali v celicah dlačic. Virus tobačnega mozaika ima na primer kristale v obliki šesterokotnika in igel - krompir X virus običajno tvori sferična amorfna telesa. Za odkrivanje virusa mozaika zelene pikice kumare, listja krompirja v zvitju in nekaterih drugih se uporabljajo metode kemijske analitične diagnostike..