Metode inokulacije rastlin

Preden nadaljujete z inokulacijo rastlin, jih je treba pripraviti. Bi morali biti brez okužb, očitno zdravi. Za to so poskusne rastline najbolje gojene iz zdravih semen v rastlinjaku ali gojijoči se hiši v cvetličnih lončkih (cvetličnih loncih), napolnjenih z zemljo brez okužb. Seme pred setvijo razkužimo z običajnimi dresurnimi sredstvi, tla pa avtoklaviramo pod tlakom 1-2 atm.

Ko gojijo rastline, zalivamo, ne da bi zmočili površino listov in stebel (voda se vlije neposredno na tla ali skozi posebej vstavljene cevi). Če je mogoče, izključite zunanjo ali naključno okužbo, ki jo prenašajo žuželke ali po zraku.

Če poskusnih rastlin v rastlinjaškem poskusu ni mogoče dobiti iz semen, se rastline, ki rastejo v naravi, odvzamejo in presadijo v lončke, po katerih se v rastlinjaku hranijo vsaj eno (po možnosti 1,5-2,0) inkubacijsko obdobje bolezni ki ga povzroča preučena gliva. Praktično za to je 7-10 dni povsem dovolj.

Pri inokuliranju rastlin z gobami na polju je potrebno predhodno izolirati določene nadzemne organe iz okolja z zastekljenimi lesenimi okvirji, papirnatimi pokrovčki, plastičnimi vrečkami, steklom bat ali steklom svetilk - slednji so privezani na kolčke, zgornje in spodnje luknje pa zapremo z bombažnimi tamponi . Takšna predhodna izolacija za obdobje 1-2 inkubacijskih obdobij je potrebna za preverjanje resnično zdravega stanja poskusnih rastlinskih organov. Poleg tega si v vseh primerih prizadevajo zagotoviti, da se izolirane rastline ali njihovi organi normalno razvijejo, niso etiolirani, klorotični, povešeni itd..

Izvesti je mogoče poskuse na odrezanih delih rastlin, namočenih v vodi, v hranilni raztopini, pa tudi na ločenih listih, danih v raztopino benzimidazola.

Načini inokulacije rastlin so precej raznoliki in so odvisni od biologije glive in vloge okužbe v patogenezi bolezni, pa tudi od ciljev študije (preverjanje patogenosti sevov, ocena odpornosti sort itd.). Razmislite o številnih tehnikah inokulacije, ki so dokaj dobro preizkušene in jih je mogoče priporočiti pri praktičnem delu..

Inokuliranje rastlin lahko izvaja patogen, gojen na umetnem hranilnem mediju, in naravna populacija glivičnih spor. Glede na nalogo uporabljajo različne inokule - micelij, spore, zbrane iz ene sorte gostiteljske rastline ali predstavljajo geografsko populacijo itd..

Pri izbiri metode inokulacije se upošteva produktivnost dela, saj se pogosto ocenjuje na tisoče sort. Načini in čas umetne okužbe čim bližje naravni. V vseh primerih se ustvarijo pogoji, ki so optimalni za rast patogenov (temperatura, vlažnost). Število cepljenih rastlin mora biti vsaj 10 z obveznim nadzorom.

Za številne bolezni (prašni smuti pšenice in ječmena, rži rži, helmintosporioza ječmena in ovsa, rumena rja pšenice itd.) Je značilno prodiranje okužbe skozi cvetove in jajčnike. V tem primeru se inokulacija opravi z nanašanjem suhih spore ali suspenzije glivičnih spor v cvetove in jajčnike. Na primer, M. K. Khokhryakov (1969) navaja, da je najpreprostejša metoda cepljenja pšenice in ječmena s prahom smuti razpršiti klamidospore povzročiteljev bolezni med cvetenjem žit iz gazovih vrečk ali izrezati prizadeta ušesa.

V. I. Krivčenko (1963) je spremenil vakuumsko metodo inokulacije pšenice s smrtonosnim patogenom s posebno napravo, sestavljeno iz valja, v katerega so nameščena ušesa, ki ostanejo na trti. Ta cilinder ima dve izstopni cevi, od katerih je ena povezana s črpalkami, druga pa služi za dovod zraka. Od spodaj se skozi poseben vakuumski vpenjalni čep in cev dovaja suspenzija spora (0,2 g spore na 0,5 l vode). Bistvo metode je, da med črpanjem iz jeklenke z ušesi zrak tam vstopi voda s sporami. Po dovodu zraka suspenzija priteče nazaj v posodo. Za pridobitev zanesljivih podatkov je dovolj, da okužimo 6-10 ušes ene sorte, pri ocenjevanju družin in linij hibridov pa vsaj tri ušesa.

E. E. Geshele (1964) razdeli metode inokulacije smutija na dve skupini: posamezno okužbo cvetov in celotnega ušesa. V prvem primeru se ena zgornja in dva spodnja špica razrežejo s škarjami, srednji cvetovi pa se odstranijo od preostalih s pinceto. Po tem se odpre vsaka roža in se s pinceto uvedejo spore. Ta metoda ima številne spremembe. Še posebej lahko cvet okužite s posebno pipeto s hruško. V drugem primeru se material, ki vsebuje nalezljiv začetek smutija, nanese na zdravo uho, potem ko je predhodno naredil zareze na ravni konice zob.

Ječmenovo cvetje inokuliramo s konidijo povzročitelja črtaste helmintosporiaze z uporabo vakuumske naprave v obdobju, ko konica še ni zapustila cevi, le konice os.

Cvetovi sadnih pridelkov se okužijo z glivami iz rodu Monilinia, in sicer tako, da na stigmo pestiča nanesejo suhe konidije z navlaženim koncem iglice. Nato cvetove poškropimo z vodo iz razpršilne steklenice in nanje položimo izolacijo gaze, namočeno v vodi, ki je en dan prekrit s plastično folijo. V južnih regijah poleg tega zasedena socvetja ne zakrijejo - enako storijo, ko okužijo ušesa.

Inokulirane sadne veje so izolirane na enak način kot cvetovi. Če se poskusi izvajajo na rezanih poganjkih, potem poganjke po nanosu okužbe na vlage odložimo v vlažne komore iz steklenih pokrovčkov, obloženih z vlažnim filtrirnim papirjem od znotraj za 24 ur pri optimalni temperaturi.

Kadar se infekcijski povzročitelji nanesejo na liste, stebla in druge organe rastlin, se praviloma uporablja suspenzija spore patogenov (konidij). Voščen premaz na površini listov otežuje prodiranje gliv, zato ga pred inokulacijo odstranimo tako, da list prehaja med mokre prste. Material, ki vsebuje okužbo, se praviloma nanese na spodnjo stran lista v obliki kapljice vodne suspenzije iz razpršila ali inokulum podrgnete po listu s skalpelom. Včasih se uporabljajo suhe spore, ki jih s sterilno krtačo nanesemo na navlažene liste..

Za umetno okužbo listov neposredno na rastlinah lahko uporabimo vlažne komore z majhno prostornino v obliki celofanskih skodelic (premera 20 mm), stisnjenih vzdolž robov z elastično vzmetjo (metoda M. S. Dunina).

Necrnjene rastline za določen čas (12, 24, 48 ur) postavimo v vlažno komoro, da zagotovimo popolnejšo okužbo. Na terenu to dosežemo z nanosom suspenzije spora v oblačnih dneh ali zvečer, še posebej, če pričakujemo roso.

Nalezljiv material žitne rje navadno pripravimo dve uri pred nanosom na rastline. Če želite to narediti, vzemite 200-300 prizadetih listov, jih potopite v vodo (0,5-1 l) in iz njih izperite uredospore. Na 150-200 m2 setve porabijo približno 150 litrov suspenzije (L. F. Rusakov, 1926). V stacionarnih pogojih se inokulum pripravi vnaprej v rastlinjaku ali na posebnih posevkih. Za okužbo parcel - distributerjev rje, je treba vzeti 5 mg uredospora na 1 m2 in jih razpršiti skupaj s smukom v razmerju 1:30 ali 1: 100. Z neprekinjeno inokulacijo na 1 m2 porabimo 2 mg sposobnih uredospor pri naknadnem premaganju rastlin s filmom in 20 mg brez mokre komore (K. M. Stepanov, 1966).

Umetna okužba rastlin z rjastimi bazidiospori (na primer linearna ali rjava) se izvaja v vlažni komori. Deli rastlin z razvitimi teletospori se odvzamejo in namestijo nad inokulirano rastlino tako, da z dozorevanjem bazidiospore padejo na njeno površino.

Obstajajo poročila o možnosti cepljenja patogenov pirikulariaze in praškaste plesni s posameznimi listi žit, nameščenih v vlažnih komorah, pa tudi majhnih krogov živih listov (premera 12-14 mm) tobaka z gobo Peronospora tabacinampak. Hkrati se namestijo v petrijeve posode, katerih dno je obloženo s tremi sloji filtrirnega papirja, nasičenih brez presežka, s hranilno raztopino naslednje sestave (v g na 100 ml vode): kalijev in natrijev tartarat (KOSO - CHON - CHON - COONa) - 0,5- K2NRO4 - 0,1 - KNO3 - 2,0 - Co (N03) 2 - 0,06 - KCl - 0,03 - MnO4 - 0,001 in Mg04 - 0,5 (Isard, 1960).

Pri preučevanju na primer obveznih zajedavcev drevesnih vrst se uporabljajo posebne metode. Pri delu z vokalumeticnimi glivami, ki povzročajo deformacijo plodov in vej, poganjke z znaki poškodb, odrezanih z obolelih dreves, postavimo v posode z vodo, da zapremo askospore, ki so pokrite s širokim steklenim pokrovčkom. Pod robom nape so nameščena tesnila z višino približno 10 cm za dostop do zraka. Po 1-2 dneh se na prizadetih organih pojavi marsupijska sporalacija glive. Nastali askospore se s sterilnim skalpelom prenesejo na eksperimentalne zdrave rastline, na jajčnike ali proge, ki se začnejo razvijati. Hkrati se tehtnica prisilno razkrije. Uporabljajo se tudi druge posebne tehnike, ki temeljijo na biologiji patogenov, ciljih poskusa in možnosti, da okužba prodre pod določenimi pogoji (Geshele, 1971).

Pri delu z povzročiteljem grahove askohitoze se po metodologiji Državne komisije za preizkušanje sorte inokulum pridobi v epruvetah na poševnem agarju. Iz ene epruvete glivične kulture pripravimo suspenzijo, tako da jo stresemo v 1 liter vode. Poleg tega naj bi bilo v povprečju 40-50 konidij povzročitelja v eni kapljici tekočine. Na 1 m2 setve porabimo 2 l suspenzije.

Semena se lahko cepijo suha ali mokra. Onesnaženost semen se izvaja pri preučevanju trde smreke pšenice. Hkrati porabimo 1 kg semen na 1 kg spore, odvisno od pričakovanih vremenskih razmer med setvijo in v prihodnjih dneh. Kadar vreme ni ugodno za razlivanje smutija, se obremenitev z okužbo poveča.Optimalni pogoji se štejejo za temperaturo tal na globini semena 6 -10 ° C. Če je treba preskusiti majhne serije semen, jih oprašimo s preveliko količino sporov in jih prepustimo skozi sito. Da bi ustvarili potrebno nalezljivo obremenitev, je treba semena ječmena in ovsa odstraniti iz filmov, E. E. Geshele (1964) priporoča odstranitev le tistega dela filma, ki pokriva zarodek. V drugih primerih se semena raztresejo s tanko plastjo na gosto površino, poškropijo s spora suspenzijo, hranijo v vlažni komori. Ječmenova in ovsena semena se tudi uspešno cepijo s smutijem s potopitvijo v spora suspenzija. Za 100 g semen pripravimo 100 cm3 suspenzije iz 4-10 g spore. Semena hranimo v suspenziji 15 minut, mešanico trikrat temeljito pretresite. Nato semena damo v vreče z gazo, pustimo, da se odcedijo z vodo in 24 ur inkubiramo pri 20 ° C. Po sušenju semena posejemo.

Ovsena semena, ki so onesnažena z butami, z odstranjenimi filmi kalijo v škatlah pri 25 vlažnosti tal in temperaturi 20 ° S. Po nastanku jih presadimo na polje. Ista metoda E. E. Geshele (1964) priporoča uporabo v primeru umetne okužbe ječmena s smutijem in povzročiteljem črtaste helmintosporioze.

Pri inokuliranju (shtambov) sadnih dreves na lubje po 1-1,5 cm nanesemo dva prečna reza, med katerima se lubje v vzdolžni smeri reže lubje, upogne krila, naredi več plitvih kosih lesa in vnese kulturo proučevalca patogena skupaj s kosom agarjevega medija. Nato se kortikalne lopute zaprejo in mesto okužbe prekrijemo s plastičnim ovojem ali pergamentom, s čimer robove pritrdimo z vrvico ali kanalnim trakom. Pri uporabi papirja se pod preliv položi navlažen kos vate..

V primeru okužbe skeletnih vej s patogeni, ki se lahko razvijejo samo v prej oslabljenih tkivih, se slednji govejo v bližini mesta inokulacije.

V primeru umetne okužbe drevesnih vrst z neobveznimi zajedavci (glive rodu Citospora in druge.) poskuse najbolje izvajati v laboratorijskih pogojih na odrezanih poganjkih. Za to so iz testne sorte odrezani lignificirani poganjki dolžine 150 mm in debeline približno 10 mm v količini 20 kosov. (10 kosov za izkušnje in nadzor). Nato se na razdalji 50 mm od vrha poganjka naredi rez do globine 5 mm - po površinski sterilizaciji se vanj položi agarni medij z glivičnim micelijem. Mesto inokulacije je zategnjeno s plastičnim ovojem, ki je na robovih pritrjen z nitmi ali izolacijskim trakom. Na hrbtni strani poganjka je pod film nameščen bombaž, ki ga po potrebi periodično navlažimo z injekcijsko brizgo skozi film.

Potaknjenci so postavljeni v kozarce z vodo ali s predhodno kalciniranim mokrim peskom. Ker so v vodi ali pesku, potaknjenci začnejo primanjkovati mineralov v zemlji, njihove vitalne funkcije oslabijo in umrejo. Ta postopek traja dolgo, kar vam omogoča, da določite čas bolezni potaknjencev različnih stopenj oslabitve, torej patogeno sposobnost glive in odpornost rastlin.

Okužene poganjke primerjamo s kontrolo po ordinalnem merilu X, običajno v času odmora 2/3 potaknjencev najbolj dovzetne sorte. V primeru, ko bo povečana tvorba kalusa prešla vzdolž robov rane, se rana očisti in izvede sekundarna inokulacija brez prekinitve poskusa.

Sadike dreves lahko inokuliramo z vnosom okužbe v steblo z medicinsko brizgo. Nalezljiv začetek korenin lahko naredite neposredno v tleh in jih poškodujete s kovinsko palico (v nastalo rano se vnesejo spore patogena).

Inokulacija plodov in koreninskih posevkov se izvede z nanašanjem suspenzije sporov patogenov na njihovo sterilno površino. V tem primeru lahko uporabite tudi suhe spore, prebodite ali zarežete kožo ploda ali z injekcijsko brizgo pod kožo vbrizgate vodno suspenzijo spor (1 kapljica). Včasih se okužba vnese v globok rez koreninskega pridelka, nato pa vrezani del vstavite na prvotno mesto.

Najpogosteje se inokulum nanese na tla, da ustvari nalezljivo ozadje, ne da bi poškodoval koreninske sisteme - gliva se najprej razmnožuje na posebnih medijih.

Za dolgoletno delo s široko paleto rastlinskih vrst in sort se uporabljajo različna nalezljiva ozadja. Lahko so naravne in umetne, razlikujejo pa se tudi po stopnji manifestacije bolezni (šibke, močne).

Pri ustvarjanju nalezljivega ozadja v tleh, na primer povzročitelji bombažne vene, čiste gobarske kulture najprej gojijo v bučkih s sterilnimi ovsenimi semeni (100 zrn na 100 cm3 vode). Nato se kulture razmnožujejo v steklenicah s sredstvom iste sestave. Na vsakih 100 m2 površine se uporabi 3-4 kg kulture (druga metoda je opisana spodaj).

Vnos glivičnih kultur v tla se uporablja tudi pri delu s povzročitelji venenja (vene) jajčevcev in popra - sklerotični povzročitelji se uporabljajo med brstenjem rastlin s predhodno poškodbo korenin.

Izvaja se cepljenje sadik ječmena in pšenice s povzročitelji helmintosporioze, fusarija, opioboleza in drugih patogenov, pri čemer se v semenske vrste skupaj s semeni vnese kultura gob. Uporabljamo čiste kulture gliv, gojenih na zrnih ali agarnih medijih (0,5 škroba, 0,02 KH2P04, 0,02 Ca (N03) 2 0,02 peptona in 2 agar agarja). Uporablja se tudi okužen oddelek slame. Vrstice med setvijo se pokrijejo z okuženo slamo s hitrostjo 20 zdrobljenih rastlin, pomešanih z 1 kg humusa na 25 m setvene vrste (E. E. Geshele, 1964).

Ko ustvarjate nalezljivo ozadje patogenov snežne plesni, mešanico sevov (Fusarium nivale, Typhula incarnata itd.), ki jih predhodno gojijo na zakisanem krompirjevem agarju in nato razmnožujejo na sterilnem ovsu. Pred vnosom kulture gob v tla jih zmešamo z zemljo v enakih količinah in jih enakomerno porazdelimo po površini ploskve. Okužba se vnese v tla jeseni s hitrostjo 200 g kulture na oves na 1 m2. Onesnaženo zemljo je od zgoraj pokrito s 1-1,5 cm zemlje, prvo leto pa se naredi infekcijsko seme. Če je hkrati izločanje rastline iz patogenov enotno, potem naslednje leto ploskvo uporabimo za poskuse (V. K. Neofitova, N. A. Novik, 1969).

Laneno laneno rjo nalezljivo ozadje (Melampsora lini) ustvarite s pomočjo slame za lič, na katero vpliva povzročitelj bolezni (mešanica sort). Takšna slama (stebla) se položi jeseni pod snegom. Spomladi se prizadeta stebla hranijo v vodi 2-3 ure, kaljivost teletospora pa se preveri, kalijo jih na 50-100 segmentih stebel v vlažni komori. Poprožene spore se štejejo 48 ur po namestitvi v vlažno komoro.

Prva metoda je uporabna pri preučevanju biologije patogenov in inokulacije posameznih rastlin, druga - pri terenskem ocenjevanju sort.

Pri ustvarjanju nalezljivega (provokativnega) ozadja povzročitelja vertiklinskih vil bombaža na ploskvi v prvem letu rastlinski odpadki, ki jih je prizadela gliva (guza-pai), dišijo in obilno zalivajo tla. Naslednje leto se opravi izravnalna setev kultivarja bombaža, dovzetnega za to bolezen, po obiranju pa prizadeti rastlinski ostanki ponovno zavohajo. Izravnalna setev je potrebna tudi za preverjanje zanesljivosti provokativnega ozadja. Šele po takšnem preverjanju se lahko šteje, da je pripravljen za testiranje sort.

Okužba lanu z antracnozo (Colletotrichum lini) izvede z vnosom okužbe v tla in škropljenje sadik s suspenzijo spora. Kot nalezljiv material se uporabljajo prizadeta lanena slama in sadike, pa tudi čista kultura patogenov, ki se goji na ovsu in agarju. Za okužbo tal se v zgornji del tal vdela čista gobarska kultura, obolele sadike in lanena slama. Rastlinske rastline se v fazi sadik cepijo s suspenzijo spora (T. V. Krylova, Yu. T. Karpunina, 1969).

Ob okužbi z belo gnilobo sončnice (Sklerotinia libertiana) uporabimo metodo, pri kateri se hkrati s semeni v vsako gnezdo s pomočjo ročnega sadilnega stroja vnesejo 2-3 majhna sklerotija povzročitelja bolezni. Navedena metoda vam omogoča, da na bazalnem delu stebla dobite znake bolezni (A. I. Lukaševič, 1969).

Povečanje zalog prahu sončnice v prahu (Plasmopara helianthi) se izvajajo na naslednji način. Najprej se pripravi zoospora suspenzija, za katero so prizadeti listi in plast mokrega filtrirnega papirja postavljeni v mokre komore. Vlažne komore vzdržujemo pri temperaturi 16-20 ° C. Zorene konidije odstranimo s površine listov z britvico ali mokrim tamponom in pripravimo suspenzijo. Inokulacija rastlin se izvede tako, da se suspenzija lepljivih semen v suspenziji hrani 5-8 ur pri temperaturi 17-19 ° C. Nato sadike sončnice posadimo v škatle velikosti 50 × 40 × 15 cm, rastlinjake ali odprto tla. V škatle in gredice rastline postavimo po shemi: med vrsticami 10-15, v vrsti 2-3 cm - v odprtem tleh - med vrsticami 45-60 in v vrsti 3-5 cm.

Povzročitelj sklerotične detelje se goji iz sklerotij na rezinah krompirja v vlažni komori. Nato rezine z razvitim micelijem parazitov postavimo pod rastline na koreninskem vratu.

Na podobne načine se povečanje števila okužb v tleh doseže z večkratnim vnosom rastlinskih ostankov, okuženih s povzročitelji drobne plesni sončnice, koreninske in koreninske gnilobe pšenice in ječmena, kobilice, zelja, askohitoze graha itd..

Patogeni v tleh (glive po porodu) Verticillium, Fusarium ipd.) sadje in jagodičje se pridelujejo v čistih kulturah na hranilnem mediju. Običajno se žitna zrna uporabljajo kot hranilni substrat, ki jih v bučkih (približno v razmerju 1: 1) nalijemo z vodo in steriliziramo v avtoklavu pod pritiskom 1 atm. Nato se v bučke z zrno vnese okužba ustrezne glive in inkubira 10-15 dni z občasnim tresenjem, da se substrat zmeša. Hkrati se semena golozrnatega pridelka (pšenica, rž, stročnice) zmešajo z drobno ali drobno sesekljano slamo, da se prepreči nastanek kašaste mase..

Stopnje uporabe takšne kulture gob v tleh se razlikujejo glede na vrsto patogena in rastlinske sorte. Kot oporo lahko vzamete 3 kg kulture na 120 m2 nasadov jagod ali 1,5-2 kg na krmno površino enega drevesa (odvisno od zasaditve).

Tako so zgornje metode inokulacije rastlin zelo raznolike, z nekaterimi spremembami so uporabne za delo s skoraj vsemi fitopatogenimi glivami na najrazličnejših kmetijskih rastlinah..