Izolacija fitopatogenih gliv v čiste kulture

Kot poudarja N. A. Naumov (1937), se nabor metod za izolacijo in gojenje gliv razlikuje v širokem razponu, odvisno od namena študije. Pojem eksperimentov pa se ujema v en sistem. Preden pridobimo preučeno glivo v čisti kulturi, je treba imeti spore, ki nosijo spore ali micelij, brez okužbe z epifitsko mikrofloro, ki včasih izkrivlja sliko, oteži prepoznavanje in izolacijo prizadetih tkiv..

Ena najpreprostejših metod za pridobitev micelija ali sporalacijskih organov (vključno s številnimi obligacijskimi zajedavci) je uporaba t.i. mokre komore. Običajno se uporabljajo za njihovo izdelavo. petrijevke ali Koka. Dno skodelic in notranja površina pokrovov sta obloženi s krogi filtrirnega papirja ustreznega premera, dve uri sterilizirani pri temperaturi 110 ° C in navlaženi s sterilno vodo. Majhni deli raziskovanih tkiv v količini 3-10 vzorcev po površinski sterilizaciji se položijo na dno skodelic neposredno na filtrirni papir, enakomerno po njegovi površini.

Površinsko sterilizacijo delov obolelih tkiv lahko izvedemo s plamenom gorilnika alkohola (plamen), vodnim tokom ali posebnimi kemikalijami. Površinski način sterilizacije naravnega substrata je primeren za les, korenine, semena ali plodove. Čim bolj voluminozen je predmet, ki ga steriliziramo, temeljiteje in dlje ga je mogoče segrevati, brez strahu za sposobnost micelija v tkivih.

Včasih je treba izolirati patogeno glivo iz polstrupljenega materiala ali blatnih delov rastline (periterapija kraste na odpadlih listih itd.). V tem primeru se preskusni predmet postavi na fino sito in nekaj ur opere pod tekočo vodo.

Nato material, odvzet za raziskave, dodatno očistimo in razkužimo s površine s potapljanjem v eno izmed naslednjih snovi: 96- ali 50-odstotni alkohol v 2-3 minutah - raztopina živega klorida (0,1-krat) z izpostavljenostjo od nekaj sekund do tri minute- 0,5-1,0-tna raztopina kalijevega permanganata (do 20 min) - prečiščena raztopina belila (prva) - 0,1-1,0-kratna raztopina bromne vode (nekaj sekund) ali v raztopine drugih razkužil sledi pranje v sterilni vodi. V ta namen lahko uporabimo formalinovo raztopino 1: 300, ki ji sledi hlajenje predmeta v posodi s hlapi od 30 minut do 2 uri.

Študije gliv, ki se razvijejo v vlažnih komorah, je treba izvajati neposredno v skodelicah pri majhnem povečanju mikroskopa v oddani ali odsevani svetlobi..

Po pojavu sporalacije ali znakov razvoja micelija ga subkultiviramo na hranilnem mediju agarja neposredno v epruveto za poševni agar ali predhodno na agarnem mediju, razlitega v petrijevih posodah. Obvezno paraziti gojijo na živih rastlinah ali posebnih okoljih.

Za nadaljnje delo je zelo pomembno čiščenje kulture. To se izvede z ožičenjem, redčenjem v sterilni vodi ali uporabo epruvete.

1. Majhna količina glive se odnese na gojitveno zanko in nanese na površino agarja v petrijevih posodah. S podaljšanjem možganske kapi se spori vedno bolj razdelijo, tako da se posledično ne pojavijo posamezne kolonije iz več ali posameznih sporov.

2. Spore inokuluma se postavijo v epruveto s sterilno vodo (10 ml), nato se določena količina suspenzije (na primer 1 ml) s sterilno pipeto prenese v epruveto z 9 ml sterilne vode. Za mešanje tekočine se uporablja sveža sterilna pipeta in se prenese 1 ml v naslednjo epruveto, ki vsebuje 9 ml sterilne vode. Vzreja se nadaljuje po potrebi. Takšno desettisočkratno redčenje ima nekaj prednosti pred ožičenjem. V končnem razredčenju dodamo 1 ml spora suspenzije staljenemu agarju, ohlajenega na približno + 40 ° C..

3. Vzemite pet epruvetov ustreznega agar medija, ga stopite in ohladite na + 45 ° C. Potem se v eno od epruvetov vnese majhna količina spore - epruveta se drsi med dlanmi rok, vsebina pa se vlije v Petrijevo posodo. Prazno epruveto znova napolnimo iz druge epruvete s staljenim medijem, pomaknemo se med roke in prelijemo v drugo skodelico. Ta postopek se ponovi z ostalimi tremi epruvetami..

Pri izvajanju teoretičnih raziskav ali analiziranju populacije katere koli geografske oblike je treba iz enega spora pridobiti kulturo. Skoraj monosporna kultura mnogih gliv se pridobiva na naslednje načine.

1. Na sterilnem steklenem drsniku v sterilni vodi se pripravi šibka suspenzija sporov s potopitvijo kalcinirane navlažene zanke v sporulacijski kulturi. Ta suspenzija sporov je narisana vzdolž črte v Petrijevi posodi na zelo tanki plošči agarja, pripravljeni v kuhani vodi in shranjeni pri + 24 ° C. Če to storimo ob 16-17 urah, potem naslednji dan ob 9-10 ur običajno opazimo začetek kalitve in pripravljenost spore za izolacijo.

Pri delu z daljnogledom (stereoskopski mikroskop) Petrijevo posodo premikamo po črti znamke in izberemo ustrezne kalčke. Ustrezna igla naredi izrez za hangar približno 2 mm okoli spore. Ta kvadrat in območje neposredno okoli njega se preverita z majhnim povečevanjem biološkega mikroskopa, da se zagotovi, da obstaja samo ena spora.

Blok vrabčevega agarja se nato s sterilno iglo pod daljnogledom prenese v agar ploščo ali cev.

2. Hranilni medij se v tanki plasti vlije v sterilne Petrijeve posode, nato se vzame epruveta s sterilno vodo in vanjo vnese majhna količina spore testne glive in se temeljito stresa v vodi. Po tem se 4-5 kapljic suspenzije spora vzame s kovinsko zanko in prenese na stekleno diapozitiv. Pod mikroskopom se šteje število spor v vsaki kapljici. Če se kap v povprečju zaključi n spore se v epruveto doda sterilna voda, da se poveča njen volumen v n+1-krat.

Poleg tega lahko domnevamo, da bo v eni kapljici v povprečju en spor. Po tem se odvzamejo 3-4 kapljice iz epruvete z razredčeno suspenzijo sporov in prenesejo v Petrijeve posode na agarnem mediju. Kapljice je treba ločiti med seboj na razmeroma veliki razdalji. Pod mikroskopom preverite število spor, ki padejo v vsako od teh kapljic. Ogled je z dna skodelice, ki je za to skrbno obrnjen. Hkrati so tiste izbrane iz kapljic, v katerih je ena spora, in jih na kozarcu označi z voščenim svinčnikom. Kolonije, dobljene v Petrijevih posodah, so pregledane v poševnih agarskih ceveh.

Včasih se kapljica suspenzije, ki vsebuje eno sporo, položi na sterilni kozarec v Petrijevi posodi in ji doda košček agarjevega medija - potem ko se micelij glive zaraste z njo, se kultura prenese v epruveto ali Petrijevo posodo.

3. Hansen (H. R. Hansen, 1926) je uporabil tanke steklene kapilare, s suspenzijo sporov spuščene v topel agar. Te kapilare smo nato mikroskopsko pregledali in razrezali na koščke, od katerih je vsaka vsebovala eno sporo. Takšne kose smo nato podvrgli površinski sterilizaciji in postavili v ploščo z agarji.

Uporabite lahko druge metode pridobivanja monospornih kultur, ki so navedene v literaturi (na primer metoda "suhe igle" Hannah in drugi). Torej, da bi iz uredospor dobili monosporno kulturo, se na suhem steklenem drsniku stresejo rjave žitarice. Nato se s koncem vlečene steklene palice loči ena spora pod daljnogledom ali z majhno povečavo mikroskopa. Konec palice predhodno obrišete z bombažno volno, navlaženo z metiliranim alkoholom ali alkoholom. Izbrana spora se v kapljici vode prenese v listje rastlin. Takšne manipulacije se izvajajo približno 200-krat, ob upoštevanju, da je stopnja preživetja običajno 6-10.

Pri izoliranju monopodilne kulture glive se izvede predhodno razmnoževanje populacije rje, tako da se na listih oblikujejo enojni uredopustuli. Za to se za inokulacijo uporablja majhna količina spore..

Ko prejmejo začetne pustule kot posledica monospore ali monopuskularne kulture glive, začnejo razmnoževati spore v njih na določenih sortah, postopek razmnoževanja rastlin po dobro razvitih sečnicah ponavljajo 2-3 krat. Kot rezultat, se nabere zadostna količina inokuluma za nadaljnje delo z njim.

Izolacija čistih kultur iz različnih organov in tkiv ima svoje značilnosti. Če površinsko poškodujemo plod, se zunanja poškodovana plast odstrani in micelij kali v vlažni komori, čemur sledi ponovno posejanje kolonije na agarnem mediju. Prej prizadeto površino temeljito operemo s sterilno vodo..

Ko izoliramo kulture iz notranjih delov ploda, jih 5 minut temeljito operemo, razkužimo v živosrebrnem kloridu (1: 100) in nato ponovno speremo v sterilni vodi, koščke sadja, odrezane iz notranjih tkiv s sterilnim skalpelom, postavimo na hranilni agar.

Pri izolaciji patogenov, ki povzročajo zunanje poškodbe korenin, uporabite tehniko, opisano za plod. Z notranjimi lezijami se korenine temeljito operejo, vnamejo, nato pa se naredijo prečni ali vzdolžni odseki. Tako dobljeni majhni koščki notranjega obolelega tkiva kalijo na gojišču agarjeve kulture..

Izolacija gliv iz listov, cvetnih listov in drugih občutljivih organov je povezana z znanimi težavami, saj je v tem primeru skoraj treba opustiti površinsko sterilizacijo s pomočjo kemikalij, ki lahko vplivajo na micelij patogena v mezofilu. Če želite povečati natančnost in zanesljivost selekcijskega dela, morate uporabiti najmanjše možne dele tkiv in hkrati povečati njihovo skupno število.

Gobe, ki okužijo lubje in les (traheomikoza, gniloba, nekroza), lahko izoliramo neposredno iz prizadetega tkiva tako, da površinsko steriliziramo koščke ali rezine na hranilni medij ali iz spore in micelije, pridobljene v vlažni komori. Les in lubje morata biti sveža, saj se glive plesni razvijejo v ustaljenih primerkih, ki zamašijo pridelek..

Prizadeti les se nekaj minut razkuži s potopitvijo v 95% alkohol ali 0,5% raztopino kalijevega permanganata, čemur sledi plamen. Nato se površinski deli vzorca razrežejo s sterilnim skalpelom ali mikrotomom, plošče od nekaj mikronov do 5-10 mm pa se od znotraj razrežejo in prenesejo v hranilni medij.

Ko izoliramo kulturo iz sadnih teles himenomicete, najprej odrežemo površinsko plast, z notranje strani sadnega nosilca pa odrežemo majhne koščke, premera 4-5 mm in polovico potopimo v hranilni agar. Nato se razviti micelij prenese v poševni agar.

Za izolacijo endogenega micelija iz mladih sadik prizadetih delov ne steriliziramo, ampak jih samo operemo, da jih ne ubijemo - material se rahlo prebavi in ​​položi na hranilni agar ali v vlažno komoro - nastajajoči micelij se hitro loči in poskuša preprečiti rast saprofitskih mikroorganizmov.

Starejše sadike razkužimo v 0,5% raztopini kalijevega permanganata, speremo z vodo in damo v vlažno komoro, od koder se razviti micelij prenese v hranilni medij. Mogoče je uporabiti tudi odseke stebla, ki so položeni na agar za kalitev micelija patogenih gliv.

Mikrofloro obolelih semen običajno analiziramo po njenem razvoju v kulturi na hranilnem mediju (M M. Samutsevich, 1931). V ta namen se odvzame skupni vzorec iz serije semen z različnih krajev, šteje se 200 semen in 25 kosov se postavi v Petrijeve posode na agarjevem mediju.

Pri določanju površinske okužbe semena ne sterilizirajo, da bi ugotovili globoko okužbo, jih hranimo v kalijevem permanganatu (0,5) 2-3 minute ali potopimo v čistem alkoholu 1 minuto.

V nekaterih primerih očiščena semena razrežemo na dva dela s sterilnim skalpelom. Močno mumificirana semena predhodno inkubiramo na filtrirnem papirju, navlaženem s sterilno vodo, po sušenju in plamenjenju jih damo v petrijeve posode. Ko se pojavi sporalacija patogena, se prenesejo v poševni agar.

Ko izoliramo čisto kulturo, glive predhodno gojimo na rahlo zakisanem agarnem mediju ali želatini (N. A. Naumov, 1937). Med prvotno izolacijo patogena ni mogoče uporabiti tekočih ali močno navlaženih medijev, ker to prispeva k razvoju saprofitskih mikrobov. Prav tako ne smete posejati patogenih gob na trden hranilni medij: riž, krompir, kruh in druge izdelke.

Za identifikacijo patogenov, ki obstajajo v tleh, se za njihovo poznejšo izolacijo odvzamejo vzorci iz značilnih razlik v tleh (podzol, černozem, serozem itd.) Na različnih globinah nekaterih kultur itd. Pri vzorčenju je oddelek tal nato sterilni. orodje loči želeno plast, iz katere se vzame vzorec 10-20 g, ki ga položi v sterilno posodo ali ovojnico. Priporočljivo je, da tla odvzamete od zgornje stoječe (do 3 cm) in globlje, na ravni lokacije glavne mase korenin. Za popolno karakterizacijo lokacije je treba v treh letih pridobiti informacije o prejšnjih posevkih in kislosti tal (pH).

Pri preučevanju porazdelitve okužbe na terenu izkopljemo zemeljske jame na vsakih 5 m na enotnem območju; za izvidniške raziskave zadostujejo 5-10 zemeljskih jam na odseku.

Zbrana tla se nekaj dni sušijo na zračno suhem stanju v papirnatih ovojnicah, zdrobijo in posadijo na hranilni medij agarja s pomočjo sterilne lopatice, skalpela in drugih orodij. Vsak vzorec (10–20 g) se porazdeli v 6–7 Petrijevih posod, nato se posoda hrani v termostatu pri temperaturi 20–25 ° C in jih redno pregleduje. Ko se razvijejo glivične kolonije, se v epruvetah prenesejo v poševni agar. Prisotnost izoliranih gliv se določi z običajnimi metodami. Po 7-8 dneh od začetka rasti kolonije postanejo skodelice neprimerne za pregled gliv zaradi onesnaževanja okolja s saprofitnimi mikroorganizmi.

Raziskovanje gliv-mikromicitov v tleh je možno tako, da jih izoliramo v čisto kulturo ali uporabimo metodo "obraščanja plošč", talne mikrokamere, pedoskope iz zelo tankega stekla in druge tehnike.

Izolacija mikroorganizmov, vključno s fitopatogenimi glivami, v vodnem stanju iz vode in zraka, je področje posebnih raziskav. Obstajajo različne metode analize z uporabo vzorčevalcev, avtomatskih volumetričnih in inercialnih lovilcev spore (F. Gregory, 1964- Yu. P. Bochkov, A.I. Voronova, V.F. Dumsky, 1966- A.I. Klochko, 1969, itd. .).